一般來說，拷貝數(shù)變異CNV（copy number variant）被定義為人類基因組中1kb或更大的DNA的片段的擴增或減少，CNV可以分為拷貝數(shù)擴增(copy number gain)和拷貝數(shù)缺失(copy number loss)，在腫瘤細胞中，往往會出現(xiàn)原癌基因的擴增，抑癌基因的缺失，擴增和缺失一般會直接影響RNA和蛋白的表達，進而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，與腫瘤細胞的生長、藥物敏感性、耐藥性都密切相關。有數(shù)據(jù)表明，CNV在人類癌癥基因組中普遍存在，比起單核苷酸多態(tài)性 (SNP) ，CNV影響更大的基因組片段。

基因CNV的檢測有多種方法，包括Southern印跡雜交、熒光原位雜交（FISH）、聚合酶鏈反應（PCR）、比較基因組雜交（CGH）、全基因組單核苷酸多態(tài)性 (SNP) 陣列和NGS等，各有優(yōu)點和缺點。

Fig 1. CNV檢測技術比較

今天我們與大家分享一篇NIST（National Institute of Standards and Technology）的文章（點擊即可查看文章內(nèi)容），是他們開發(fā)2373標準物質(zhì)的過程：針對HER2的gDNA標準品，主要是用于Q-PCR和dPCR的，當然也是適用于NGS，但是由于檢測方法不同、分析方法不同，在定值上會與Q-PCR和dPCR不一致。

首先文章發(fā)現(xiàn)很多乳腺癌患者的樣本存在大量的染色體結(jié)構(gòu)異常，在開發(fā)Q-PCR和dPCR時，需要

選擇內(nèi)參基因，內(nèi)參基因的選擇要盡量避開染色體異常的區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)，這些乳腺癌樣本在1q, 8q, 20q, 7, 11q, 13, 17q, 9q ,16p等區(qū)域經(jīng)常發(fā)生基因的擴增，在8p, 11q14-qter, 18q, Xq等區(qū)域經(jīng)常發(fā)生基因的缺失，同時內(nèi)參基因的選擇盡量不能在chr17（HER2基因的位置）上選擇，因此文章最終選擇了DCK基因、EIF5B基因、RPS27A基因和PMM1基因（其中PMM1僅用于Q-PCR實驗）。

Table 1. HER2和內(nèi)參基因的引物信息

Table 2. HER2和內(nèi)參基因的探針信息

作為一個標準品，需要盡量模擬臨床樣本，同時需要穩(wěn)定的長久供應，因此文章選擇了5個常見的乳腺癌細胞作為標準品的原材料，用于定標實驗，分別為：SK-BR-3(components A), MDA-MB-231(components B), MDA-MB-361(components C), MDA-MB-453(components D)和 BT-474(components E)，這些細胞經(jīng)過培養(yǎng)，提取gDNA，STR鑒定，確保質(zhì)量合格，備用于接下來的測試。

同時文章構(gòu)建了一個HER2 cDNA的質(zhì)粒，通過質(zhì)粒的分子量，計算得到質(zhì)量與拷貝數(shù)的對應關系，構(gòu)建標準曲線，同時引入2372-A樣本（全基因組DNA: gDNA），也構(gòu)建質(zhì)量與拷貝數(shù)的關系，通過Q-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)有很強的相關性，R2=0.9924，進而得到2372-A樣本在二倍體時，對應HER2的拷貝數(shù)為2，進而可以用于components A-E的檢測校準。

接下來對components A-E開展Q-PCR和dPCR的檢測，Q-PCR采用4種內(nèi)參基因，根據(jù)校正標曲計算得到A-E樣本的copies/μL，dPCR采用3種內(nèi)參基因，同時計算A-E樣本的copies/μL和與內(nèi)參基因的比值，在這里，文章中使用了2種dPCR的方法，分別為

droplet dPCR和chamber dPCR。

在計算上，首先通過質(zhì)粒HER2 cDNA的Q-PCR數(shù)據(jù)，校正2372-A的gDNA樣本，顯示2372-A樣本二倍體樣本，HER2拷貝為2，再利用2372-A樣本計算A-E樣本的拷貝數(shù)值（copies/μL），dPCR則直接檢測HER2和內(nèi)參基因的拷貝數(shù)，進而計算比值。

最終文章顯示首先2種dPCR采用3種內(nèi)參基因，計算HER2與內(nèi)參基因的比值，結(jié)果有很強的

一致性，5個樣本出現(xiàn)不同程度的拷貝數(shù)擴增，有弱有強。

Fig 2. 針對A-E樣本，2種dPCR的方法一致性較好。（數(shù)據(jù)為3種內(nèi)參的平均值）

其次A-E樣本在Q-PCR和dPCR上針對copies/μL也有很強的一致性，表明A-E標準品同時適用于Q-PCR和dPCR應用。

另外文章還檢測了A-E樣本的穩(wěn)定性，在長達856天的測試中，不管是絕對的拷貝數(shù)，還是與內(nèi)參的比值，都呈現(xiàn)良好的穩(wěn)定性。

最后文章還測試了隨機因素對A-E實驗的重復性的影響，比如機器、操作者、日期等等，呈現(xiàn)良好的重復性。

綜上可知，在開發(fā)CNV檢測的分子診斷標準品時，我們需要注意：

● 可以設置絕對的拷貝數(shù)值（copies/μL）作為標準，可以使用dPCR和Q-PCR定標，其中Q-PCR需要使用校正標曲；

● 可以設置與內(nèi)參基因的比值，作為標準，適合dPCR的方法（Q-PCR也可以，同樣需要校正標曲），這時需要注意內(nèi)參的選擇原則，如果可以的話，盡量多選擇幾個內(nèi)參基因；

● 標準品需要穩(wěn)定供應，需要測試長久的穩(wěn)定性，測試在不同的隨機因素下的重復性；

但是我們發(fā)現(xiàn)還是有一些問題沒有解決，比如：Q-PCR和dPCR都是很短序列的PCR反應，在整個HER2基因的什么

區(qū)段選擇擴增？不同區(qū)段的擴增效率會直接影響拷貝數(shù)值（copies/μL），進而不同區(qū)段檢測得到的拷貝數(shù)與內(nèi)參基因的比值也會不一致，甚至是否會出現(xiàn)PCR反應正好設計在各個拷貝的差異處，就不僅僅是擴增效率的問題了。

另外在文章之外，我們可以

探討下：這個標準品是否適用于NGS？我們知道NGS是比較各處的測序深度，進而判斷區(qū)域的拷貝數(shù)，與Q-PCR和dPCR的檢測方法差異很大，看起來NGS會檢測到不一樣的結(jié)果。